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研磨儀與分散儀在蛋白表達(dá)水平檢測(cè)方面的應(yīng)用

發(fā)布時(shí)間:2024-11-01 來源:新芝生物 瀏覽量:0
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實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

  為了解大鼠肺組織中炎癥因子蛋白表達(dá)情況,需要將組織內(nèi)的蛋白盡量釋放并收集,使用研磨和超聲手段,對(duì)肺組織進(jìn)行勻漿和細(xì)胞破碎,最終分離得到溶液中的蛋白進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn),從而了解蛋白表達(dá)情況。

實(shí)驗(yàn)步驟

  取0.2 g大鼠右肺組織樣本,切碎,取適量溶解并混勻后的RIPA裂解液,使用前加入酶抑制劑,在每100 mg右肺組織樣本內(nèi)加入 1 mL 的RIPA裂解液,后使用SCIENTZ-24高通量組織研磨器將組織充分研磨勻漿,于4℃的條件下裂解 30~60 min,將裂解后的組織置于SCIENTZ-1500F超聲分散儀上破碎,用高速離心機(jī)10000 r/min 離心10 min,取上清液。提取總蛋白并利用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度,于100℃水中煮5 min,使蛋白變性后,置于冰上使其驟冷,提取為實(shí)驗(yàn)使用的蛋白樣本,置于-20℃冰箱中冷凍保存。使用蒸餾水清洗干凈灌膠玻璃板,豎直放置使其自然晾干。分別使用分離膠、5%濃縮膠處理后,將凝膠置于電泳槽進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到預(yù)先準(zhǔn)備的 NC 膜上,制備轉(zhuǎn)膜“三明治”,在電轉(zhuǎn)儀中轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,搖床洗膜,封閉液封閉1~2 h倒掉封閉液,加入稀釋的相應(yīng)抗體。在搖床上4℃ 過夜,TBS-T洗膜3次,每次10 min,加入二抗。二抗孵育結(jié)束后,于搖床上用TBST洗膜5~10 min ×3次。加ECL工作液于印跡膜上30~60 s,吸干發(fā)光液,置印跡膜于成像分析儀自動(dòng)成像,軟件ImageJ分析蛋白條帶灰度值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

  各組大鼠肺組織中IL-17、IL-22、IL-10、IL-35蛋白表達(dá)情況比較與空白組比較,模型組和假 貼組肺組織中 IL-17、IL-22蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05),IL-10、IL-35蛋白相對(duì)表 達(dá)量均明顯降低(P均<0.05) ; 與模型組和假貼組比較,地塞米松組、發(fā)酵組、非發(fā)酵組肺組織中IL-17、IL-22蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0. 05),IL-10、IL-35蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高( P均<0.05) ; 地塞米松組、發(fā)酵組、非發(fā)酵組間各指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P均>0.05)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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